Как получают интерферон

Posted on by admin

Противовирусный препарат «Интерферон»: отзывы, инструкция по применению и особенности

В последние годы вокруг очень много говорят и пишут об интерферонах. Порой им приписывают лечебные свойства панацеи от различных болезней, а иногда их считают неподтверждённой фантазией людей науки.

Оглавление:

Давайте разберёмся, что же собой представляют такие препараты, нужно и можно ли вообще при помощи них лечиться.

Интерферонами называются вещества, которые имеют белковую природу и обладают защитными механизмами. Они выделяются клетками организма при внедрении в него болезнетворных вирусов. Именно такие белки являются своего рода барьером естественного происхождения, который останавливает проникновение вируса в организм.

Кем и когда был открыт «Интерферон»

«Интерферон» был открыт в 1957 году британским учёным-вирусологом А. Айзеком и его коллегой из Швейцарии доктором Д. Линдеманом, проводившими опыты над лабораторными мышами, которые были заражены вирусными заболеваниями. Во время этих опытов учёный и его коллега заметили странную закономерность, заключающуюся в том, что мыши, которые уже были больны одним типом вируса, не заражались другими вирусами. Позже это явление назвали интерференцией (иначе говоря, естественная защита). Собственно, название интерферонов произошло именно от этого слова.

В последующем интерфероны, которые вырабатываются организмом человека, разделили на группы. Их классифицируют по типу клеток, выделяемых интерферонами. В данной статье будет рассмотрена к «Интерферону» инструкция по применению. Цена и отзывы также будут представлены.

Разновидности

Так, выделяют следующие виды:

  • Альфа-интерферон, по отзывам специалистов, вырабатывается лейкоцитами, его еще называют лейкоцитарным.
  • Бета-интерферон продуцируется фибробластами (клетками соединительной ткани), его называют также фибробластным.
  • Гамма-интерферон синтезируется природными киллерами, макгофагами и лимфоцитами, его еще называют иммунным.

В медицинской деятельности в основном применяют интерферон группы альфа. Именно его используют для лечения вирусных заболеваний различной природы. Известно, что в настоящее время интерфероны группы бета применяют в современной терапии рассеянного склероза. К препарату «Интерферон» инструкция по применению и отзывы интересуют многих.

Интерфероны и их принцип действия

Когда патогенные вирусы попадают в организм, они начинаются активно воспроизводиться. Клеточная структура, поражённая этими вирусами, приступает к синтезу интерферонов, которые начинают действовать внутри клетки, а потом выходят из неё и передают информацию соседним клеткам. К сожалению, интерферон не может полностью уничтожить вирусы, его механизм действия основан на удержании передвижения и активного воспроизводства вирусных частиц.

По отзывам, «Иинтерферон» — отличный препарат. Он обладает следующим механизмом действия:

  • активно угнетает процессы воспроизводства вирусных частиц;
  • активирует клеточные ферменты рибонуклеазы-L и протеикиназы-R, которые задерживают синтез белков вируса, а также разделяют в клетках РНК на части (в том числе и в клетках вирусов);
  • активизирует выработку белка р53, который вызывает гибель заражённой клетки.

Помимо угнетающего влияния на воспроизводство вирусных частиц, интерфероны активизируют иммунные реакции организма. Эта активизация ферментов клеток приводит к стимуляции защитных кровяных клеток (макрофагов, Т-хелперов, киллеров).

Интерфероны обладают очень высокой агрессивностью и активностью. Нередко лишь одна их частица способна сделать клетку более устойчивой к воздействиям вирусных тел, а также снизить на 50 % их воспроизводство.

Также интерфероны обладают сопутствующим эффектом подавления онкологических клеток.

По отзывам, «Интерферон» в нос детям часто назначают врачи во время простудных заболеваний.

Как получают?

Для получения интерферонов применяют следующие способы:

  • Инфицирование безопасными штаммами вирусов лимфоцитов и лейкоцитов человека. После этого клетками начинает выделяться интерферон, который подвергают различным технологическим методам обработки и в итоге превращают его в форму лекарства.
  • Рекомбинантный метод, при котором бактерии, имеющие в ДНК геном интерферона, выращивают искусственно.

Благодаря описанной выше информации, можно выделить следующие формы интерферона:

  • Интерфероны лимфобластоидные – их получают из материалов естественной природы.
  • Интерфероны рекомбинантные являются синтетическими аналогами интерферонов человека.
  • Интерфероны пегилированные выделяются вместе с полиэтиленгликолем, который позволяет дольше действовать интерферонам. Этот вид обладает усиленными лечебными свойствами.

Показания к применению

Результат лечением «Интерфероном» будет зависеть от того, насколько рано была начата терапия.

По отзывам, «Интерферон» назначают в комплексной терапии для лечения гриппа, вирусных гепатитов, ОРВИ, рассеянного склероза, герпетических заболеваний, а также при иммунодефицитных состояниях и злокачественных новообразованиях.

Лекарственные формы

Самым оптимальным способом введения интерферонов является парентеральный (внутримышечные инъекции), потому что они имеют белковую структуру, которая разрушается в пищеварительном тракте. При данном способе введения препараты обладают максимальным эффектом и практически полностью усваиваются организмом. Лекарственное средство распределяется неодинаково по тканям. В тканях органов зрения и нервной системы наблюдаются низкие концентрации интерферонов. Данные лекарственные препараты выводятся почками и печенью.

Наиболее часто используют «Интерферон» в форме свечей, капель в нос «Интерферон» (по отзывам, они очень популярны) и раствора для инъекций.

Побочные эффекты при лечении

В начале лечения интерферонами могут наблюдаться следующие побочные реакции:

  • незначительное увеличение температуры тела человека;
  • болезненные ощущения в глазных яблоках и мышцах тела;
  • чувство слабости и тяжести в теле, а также ощущение разбитости.

Это подтверждают к «Интерферону» инструкция и отзывы. Цена будет указана ниже.

На поздних этапах лечения возникают:

  • снижение показателей гемоглобина, эритроцитов и тромбоцитов;
  • упадок настроения, нарушения сна, головные боли, судорожные подёргивания, проблемы сознания и головокружения;
  • проблемы со зрением, вызванные нарушением кровообращения в сосудах глазных мышц и окружающих тканей;
  • нарушения кровообращения мозга;
  • понижение давления, появление аритмии сердца, иногда применение препарата может привести к развитию инфаркта миокарда;
  • воспаление лёгких, различные формы кашля с одышкой, также были зафиксированы остановки дыхания;
  • нарушение функций щитовидной железы;
  • высыпания на коже;
  • отсутствие аппетита, сопровождаемое неприятным привкусом во рту, тошнотой, рвотой, иногда применение препарата провоцирует кровотечения пищеварительного тракта;
  • в редких случаях наблюдается выпадение волос.

Чем эффективен интерферон бета? Отзывы рассмотрим ниже.

Какие препараты интерферона применяют в настоящее время?

Современный рынок лекарственных средств выпускает широкий спектр интерферонов:

  • «Реаферон» применяют при вирусных гепатитах, лейкозах, злокачественной опухоли в почках и кондиломатозе.
  • «Вэллферон» по действию аналогичен «Реаферону». Назначают при опухолевых и вирусных патологиях.

Практически все лекарственные средства рекомбинантного действия применяются для лечения вирусных заболеваний, также их назначают в комплексной терапии онкологических заболеваний, опоясывающего лишая, герпетических инфекций и рассеянного склероза.

Вышеописанные лекарственные средства выпускают в формах растворов для инъекций, капель для глаз и носа, мазей.

«Интерферон» в нос, по отзывам, можно приобрести в любой аптеке.

Противопоказания к применению

Интерфероны нельзя применять при некоторых заболеваниях и состояниях. К ним относятся:

  • судорожные состояния и тяжёлые заболевания психики;
  • нарушения кровообращения любой природы;
  • заболевания дыхательной и сердечно-сосудистой систем;
  • нарушения функций печени, протекающие в хронической форме;
  • тяжёлые формы сахарного диабета.

Это подтверждают к «Интерферону» инструкция и отзывы.

Применять интерфероны во время беременности и в период лактации можно только в случае необходимости после консультации лечащего врача.

Особенности применения в детском возрасте

«Интерферон» (капли), по отзывам, запрещено применять детям в возрасте до года. Для более старших возрастов препараты подбираются строго индивидуально, исходя из возраста, состояния и болезни ребёнка.

Индукторы интерферона

К индукторам относятся препараты, которые не являются интерферонами, но способны стимулировать синтез собственно интерферона.

Эти индукторы начали разрабатывать еще в 70-х года прошлого века, но тогда их не включили в терапевтическую практику из-за высокой токсичности и низких показателей эффективности, что приводило к тяжёлым побочным реакциям. В современной медицинской деятельности эти проблемы практически решились, и индукторы интерферона заняли свою достойную нишу.

Выделяют два типа индукторов интерферона: естественного природного происхождения и синтетические.

На сегодняшний день разработано более десятка таких препаратов, которые обладают низким антигенном свойством, что расширило их спектр применения.

Наиболее часто применяют следующие индукторы интерферона:

  • «Амиксин» является самым первым лекарственным средством этой группы. Его выпускают в форме таблеток, обладающих длительным действием. Он способен проникать в ткани кишечника, мозга и печени, что позволяет применять его при заболеваниях разной природы. Стоит около 500 рублей.
  • «Неовир» способен активировать естественные киллеры. Его выпускают в форме раствора для инъекций. Чаще всего назначают при гриппе, вирусных гепатитах и злокачественных опухолях. Ценаруб.
  • «Циклоферон» способен усиливать синтез всех типов интерферона организма. Его выпускают в форме растворимого порошка или в ампулах для инъекций. Применяется для лечения вирусных воспалений печени, герпетический сыпей, клещевого энцефалита, цитомегаловируса. Стоимость — примерно 200 рублей.
  • «Полудан» применяется в офтальмологии. Его назначают пи заболеваниях глаз герпетической природы. Цена руб.
  • «Кагоцел» оказывает воздействие преимущественно на селезёнку, кровь, почки, печень и органы, которые содержат лимфоидую ткань. Эта уникальность позволяет назначать его при вирусных поражениях локального характера. Стоит примерно 270 рублей.

Цена и отзывы об «Интерфероне»

Стоимость «Интерферона» в ампулахрублей. «Интерферон бета» 1a и 1b стоит от 13 до 28 тысяч рублей в России.

На капли в нос цена начинается со 187 рублей.

Свечи для детей — от 300 рублей. Стоимость «Интерферона альфа» и «Рибавирина» сильно варьируется.

Отзывы об альфа-, бета- и гамма-интерферонах чаще всего положительные. Препарат рекомендуют более 95 % пациентов, которые применяли их для лечения.

Для детей средство подходит идеально, не только позволяет вылечить уже заболевшего ребенка, но и существенно повышает его иммунную защиту, по этой причине организм может противостоять инфекциям.

Подводим итоги

По отзывам, «Интерферон» — это противовирусный иммуномодулирующий препарат. Действие его основано на повышении резистентности, т. е. невосприимчивости организма к инфекциям, а также увеличению активности клеток иммунной системы. Показания к применению – это гепатиты группы В и С, онкологические заболевания и вторичные иммунодефициты. Научная медицина может доказать эффективность лечения интерфероном лишь тогда, когда речь идёт о тяжёлых формах болезни. Относительно терапии и профилактики острых респираторных вирусных инфекций, в том числе и гриппа, вся группа интерфероновых препаратов не имеет доказанной эффективности. Пациентам важно знать, что при появлении первых признаков гриппа рекомендуется обратиться к врачу, и помнить о необходимости профилактики и своевременного лечения данных заболеваний.

Нами рассмотрена к «Интерферону» инструкция. Цена, отзывы, цены аналогов также описаны.

Источник: http://www.syl.ru/article/349372/protivovirusnyiy-preparat-interferon-otzyivyi-instruktsiya-po-primeneniyu-i-osobennosti

Интерферон

Об интерферонах последние годы много пишут и говорят. Иногда им приписываются свойства панацеи от разных заболеваний, а иногда они считаются неподтвержденными фантазиями ученых. Давайте попробуем разобраться, что же представляют собой эти препараты, можно и нужно ли при их помощи лечиться.

Интерфероны – это вещества белковой природы, обладающие общими защитными свойствами. Продуцируются они клетками организма в ответ на внедрение болезнетворных вирусов. Именно эти белки являются естественным барьером, останавливающим проникновение вируса в организм человека.

Кто и когда открыл интерферон

Годом открытия интерферона признан 1957. Британский ученый вирусолог А. Айзек и его коллега из Швейцарии д-р Д. Линдеман проводили опыты над мышами, зараженными вирусными болезнями. Во время экспериментов была замечена странная закономерность – уже больные одним видом вируса мыши не поддавались заражению другими вирусами. Явление получило название – интерференция (то есть естественная защита). От этого слова и произошло оригинальное название интерферонов.

Со временем интерфероны, вырабатываемые клетками человека, распределили по группам. В основу классификации положены типы клеток, которые выделяют интерфероны.

  • интерферон (ИТФ) альфа (лейкоцитарный, вырабатываемый лейкоцитами);
  • интерферон (ИТФ) бета (фибробластный, продуцируемый клетками соединительной ткани – фибробластами);
  • интерферон (ИТФ) гамма (иммунный – вырабатывается лимфоцитами, макрофагами и природными киллерами).

Основное применение в медицине нашли интерфероны альфа группы. Именно они принимают участие в лечении большинства вирусных патологий. ИТФ-бета опробованы в терапии клинических проявлений рассеянного склероза.

Какое действие оказывают интерфероны

При попадании в организм патогенные вирусы проникают в клетки, и приступают к активному процессу воспроизводства. Пораженная болезнетворным началом клеточная структура начинает продуцировать интерфероны, которые действуют внутри и выходят за ее пределы для передачи информации клеткам-«соседям». Интерферон не способен уничтожать вирусы, его действие основано на сдерживании активного размножения вирусных частиц и их способности к передвижению.

Механизм действия интерферона:

  • активно снижает процессы синтеза вирусов;
  • вызывает активацию клеточных ферментов протеинкиназы R, и рибонуклеазы-L, которые вызывают задержку производства белковых молекул вируса, а также расщепляют РНК в клетках (в том числе – в вирусах);
  • инициирует синтез белка p53, обладающего способностью вызывать гибель пораженной клетки.

Как видим, интерфероны способны разрушать не только чужеродные вирусы, но и структуры человеческих клеток.

Помимо губительного влияния на размножение вирусных тел интерфероны стимулируют иммунные реакции. Стимуляция клеточных ферментов приводит к противовирусной активации защитных клеток крови (Т-хелперов, макрофагов, киллеров).

Активность и агрессивность интерферонов очень высока. Иногда одна частица интерферона может полностью обеспечить устойчивость клетки к неблагоприятным воздействиям вирусов, а также уменьшить их размножение на 50%.

Обратите внимание: от момента начала действия препаратов интерферона до уровня полноценной защиты уходит около 4 часов.

Из сопутствующих эффектов следует отметить способность ИТФ к подавлению клеток злокачественных опухолей.

О механизме действия медицинского препарата — Интерферона рассказывает иммунолог-аллерголог, сотрудник кафедры иммунологии РНИМУ им. Н.И Пирогова Белла Брагвадзе:

Способы получения интерферонов, классификация

Для получения интерферона применяются методы:

  • инфицирования человеческих факторов защиты крови (лимфоцитов, лейкоцитов) определенными безопасными штаммами вирусов. Затем выделяемый клетками интерферон проходит технологические методы обработки и превращается в лекарственную форму;
  • генного конструирования (рекомбинантный) – искусственное выращивание бактерий (чаще всего кишечных палочек), с имеющимся геном интерферона в ДНК. Запатентованное название интерферона, выпускаемого по этой методике, – «Реаферон».

Обратите внимание: производство «Реаферона» намного дешевле лейкоцитарного интерферона, а эффективность может быть большей. Рекомбинатный интерферон применяется при лечении не только вирусных заболеваний.

Исходя из полученной информации, выделим основные виды интерферона:

  1. Лимфобластоидные ИТФ – полученные из естественных материалов.
  2. Рекомбинантные ИТФ – синтетические аналоги человеческих итерферонов.
  3. Пегилированные ИТФ – синтезируются совместно с полиэтиленгликолем, позволяющим интерферонам действовать дольше обычного срока. Они обладают более сильным лечебным действием.

Когда необходимо применение интерферона

Чем раньше начато лечение интерфероном, тем лучшего результата удается добиться. Именно эта закономерность используется для профилактического назначения этих препаратов.

Интерферон применяется в комплексе лечебных мероприятий при гриппе, вирусных гепатитах, герпетических заболеваниях, рассеянном склерозе, злокачественных новообразованиях, иммунодефицитных состояниях.

Обратите внимание: лейкоцитарные интерфероны в настоящее время практически вышли из употребления в связи с возможными побочными эффектами и нестабильностью состава, а также дороговизной производства препарата.

Формы применения интерферонов

В связи с тем, что интерфероны являются белковыми структурами, они разрушаются в желудочно-кишечном тракте, поэтому самый оптимальный способ их введения – парентеральный (инъекции в мышцу). В этом случае препараты усваиваются практически полностью и обладают максимальным эффектом. Распределение по тканям лекарственных средств неодинаковое. Низкие концентрации ИТФ наблюдаются в нервной системе, тканях органов зрения. Выводятся лекарства печенью и почками.

Наиболее часто используемые лекарственные формы:

  • интерферон в свечах,
  • интерферон в виде капель в нос,
  • интерферон в ампулах для инъекций.

Побочные эффекты лечения интерферонами

Применение интерферонов в начале лечения может спровоцировать:

  • незначительное повышение температуры;
  • боли в мышцах, глазных яблоках;
  • слабость и тяжесть в теле, ощущение разбитости;
Ранние проявления побочных эффектов обычно быстро уходят и не требуют дополнительного лечения.

В более поздние сроки могут возникнуть:

  • уменьшение количества эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов. Также может наблюдаться появление патологических форм клеток крови;
  • нарушения сна, упадок настроения, судорожные подергивания, головные боли и головокружения, проблемы сознания;
  • преходящие нарушения мозгового кровообращения;
  • проблемы со зрением (вызваны они проблемами в сосудах, питающих глаза, глазные мышцы и окружающие ткани);
  • проявление аритмии сердца, понижения давления, в некоторых случаях развитие инфаркта миокарда;
  • разные виды кашля с явлениями одышки, воспаления лёгких. Описан случай остановки дыхания;
  • патология щитовидной железы;
  • кожные высыпания;
  • проблемы с аппетитом, сопровождающиеся тошнотой, неприятным привкусом, рвотой, иногда возникновением желудочно-кишечного кровотечения;
  • появление активности печеночных трансаминаз (ферментов, показывающих проблемы в печеночной ткани);
  • случаи выпадения волос.

Препараты интерферона, применяемые в настоящее время

Современная фармацевтическая промышленность поставляет на отечественный рынок широкий спектр лимфобластоидных, рекомбинантных и пегилированных интерферонов:

  1. Лимфобластоидные:
  • «Веллферон» – назначается при лейкозах, вирусных гепатитах, раке почки и кондиломатозе;
  • Реаферон – аналогичен по действию Веллферону. Применяется при вирусных и опухолевых патологиях.
  1. Рекомбинантные:
  • Лаферобион.
  • Роферон.
  • Реальдирон.
  • Виферон.
  • Гриппферон.
  • Генферон.
  • Ингарон.

Все рекомбинантные лекарственные средства нашли применение при вирусных заболеваниях, вошли в состав комплексного лечения онкологических проблем, герпетических инфекций, опоясывающего лишая, рассеянного склероза.

Выпускаются в формах стерильных растворов для инъекций, мазей, каплей для носа и глаз. Каждый из препаратов интерферона содержит инструкцию по применению.

При каких заболеваниях показаны препараты интерферона

Лечение ИТФ применяется при всех состояниях, связанных с дефицитом интерферонов.

Чаще всего эти препараты задействуют при:

Есть ли противопоказания к назначению интерферонов

Некоторые состояния и болезни не позволяют применять препараты ИТФ.

Интерфероны не следует назначать при:

  • тяжелых психических заболеваниях, судорожных состояниях;
  • при нарушениях со стороны крови;
  • декомпенсированных болезнях сердечнососудистой и дыхательной систем;
  • заболеваниях печени, протекающих с тяжелой формой цирроза;
  • тяжелых формах сахарного диабета;

При беременности и грудном вскармливании ИТФ назначают только в случае строгой необходимости или по жизненным показаниям.

Применение интерферонов в детской практике

Интерферон детям до года не применяют. В более старшем возрасте каждый препарат подбирается индивидуально, в зависимости от возраста, состояния и заболевания ребенка.

Об особенностях применения интерферона и других противовирусных препаратов для детей в данном видео-обзоре рассказывает педиатр, доктор Комаровский:

Индукторы интерферона

Эта группа препаратов интерферонами не является, но способна стимулировать реакции выработки собственного ИТФ.

Индукторы начали разрабатываться с 70-х годов прошлого века, но они не вошли в те годы в клиническую практику из-за низкой эффективности и высокой токсичности, приводящей к тяжелым побочным реакциям. В настоящее время эти проблемы практически полностью решены, и индукторы заняли в современной медицине свою достойную нишу.

Выделяют две группы индукторов интерферона:

  • природного происхождения (производимые из дрожжевых продуктов и бактериофагов);
  • синтетические (препараты акридонуксусной кислоты и флуоренонов).

Важно: за пределами России и других государств СНГ индукторы ИТФ не применяются ввиду отсутствия доказательств их клинического действия.

В настоящее время разработано более 10-ти препаратов, обладающих низкими антигенными свойствами, что существенно расширило возможности их применения.

Наиболее значимыми индукторами интерферонов считаются:

  • Амиксин – самое первое лекарственное средство этой группы. Выпускается в таблетированной форме, обладает продолжительным действием. Проникает в ткани мозга, кишечника и печени, что способствует применению его при разных заболеваниях.
  • Неовир – обладает способностью активации естественных киллеров. Выпускается в ампулах для уколов. Применяется при вирусных гепатитах, гриппе, опухолях.
  • Циклоферон – усиливает выделение всех видов интерферонов организма. Выпускается в ампулах и в виде растворимого порошка для инъекций.

Лотин Александр, врач-рентгенолог, нарколог

23,189 просмотров всего, 4 просмотров сегодня

Похожие записи
Энтеросорбенты: обзор популярных препаратов
Лечение аллергии. Обзор антигистаминных препаратов третьего поколения
Ремантадин и алкоголь
  • Аллергология (43)
  • Андрология (104)
  • Без рубрики (3)
  • Болезни сосудов (20)
  • Венерология (64)
  • Гастроэнтерология (151)
  • Гематология (38)
  • Гинекология (113)
  • Дерматология (119)
  • Диагностика (144)
  • Иммунология (1)
  • Инфекционные болезни (140)
  • Инфографика (1)
  • Кардиология (56)
  • Косметология (182)
  • Маммология (18)
  • Мать и дитя (173)
  • Медицинские препараты (311)
  • Неврология (120)
  • Неотложные состояния (82)
  • Онкология (61)
  • Ортопедия и травматология (115)
  • Оториноларингология (86)
  • Офтальмология (42)
  • Паразитология (31)
  • Педиатрия (155)
  • Питание (382)
  • Пластическая хирургия (9)
  • Полезная информация (1)
  • Проктология (56)
  • Психиатрия (66)
  • Психология (27)
  • Пульмонология (58)
  • Ревматология (27)
  • Сексология (24)
  • Стоматология (64)
  • Терапия (77)
  • Урология (99)
  • Фитотерапия (21)
  • Хирургия (90)
  • Эндокринология (97)
Информация предоставляется с целью ознакомления. Не занимайтесь самолечением. При первых признаках заболевания обратитесь к врачу. Имеются противопоказания, необходима консультация врача. Сайт может содержать контент, запрещенный для просмотра лицам до 18 лет.

Источник: http://okeydoc.ru/interferon/

Интерфероны, природа, способы получения и применения

Интерферон относится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфицированные одним вирусом, становились нечувствительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладающим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами и он получил название лейкоцитарного; бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами — клетками соединительной ткани, а гамма-интерферон — иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови держится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 международная единица — ME — это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД50 вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов.

Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действия интерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона. Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или поступать в организм извне. Поэтому его используют с профилактической целью при многих вирусных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепатиты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и заболеваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффективен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.

Получение интерферона. Получают интерферон двумя способами: а) путем инфицирования лейкоцитов или лимфоцитов крови человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом — путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, полученный генно-инженерным способом, носит название рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил официальное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел широкое применение в медицине как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

Источник: http://biofile.ru/bio/10255.html

способ получения человеческого иммунного интерферона

Использование: биотехнология, медицинская промышленность. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантную плазмиду pSV 69, включающую фрагмент ДНК-кодирующий предшественник иммунного интерферона человека; трансформируют полученным рекомбинантным вектором линию клеток СОS-7, отбирают трансформированные клетки, которые культивируют в условиях, обеспечивающих накопление целевого продукта, и выделяют зрелую форму интерферона без N-концевых Сys-Туr-Сys (des-Суs-Тyr- Сys интерферон). 8 ил.

Рисунки к патенту РФ

Изобретение относится к технологии рекомбинантных ДНК, к средствам и способам использования такой технологии при раскрытии последовательности ДНК и определяемой ею последовательности аминокислот для иммунного интерферона человека, его получения, а также к полученным при этом различным продуктам и их использованию.

Более конкретно настоящее изобретение относится к выделению и идентификации последовательностей ДНК, кодирующих иммунный интерферон человека и к построению рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего эти последовательности ДНК, оперативно связанные с последовательностями промотора, и к осуществлению экспрессии с полученными таким образом векторами. В другом аспекте настоящее изобретение относится к системам культуры хозяина, таким как различные микроорганизмы и культуры клеток позвоночных, трансформированные векторами экспрессии и таким образом направленные на экспрессию указанных ранее последовательностей ДНК. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к средствам и способам превращения конечных продуктов такой экспрессии в новые объекты, такие как фармацевтические композиции, пригодные для лечения и профилактики людей.

В предпочтительных вариантах настоящее изобретение предлагает конкретные векторы экспрессии, которые имеют такие последовательности, что иммунный интерферон человека продуцируется и выделяется из клеток хозяина в зрелом виде. Кроме того, настоящее изобретение относится к различным процессам, используемым для получения таких последовательностей ДНК, векторов экспрессии, систем культур хозяина и конечных продуктов и их производных, а также к конкретным и связанным с ними условиям.

Настоящее изобретение частично вытекает из открытия последовательности ДНК и установленной аминокислотной последовательности, кодирующей иммунный интерферон человека. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет информацию о последовательности 3″- и 5″ — боковых последовательностей гена иммунного интерферона человека, что облегчает связывание его in vitro в векторы экспрессии. В частности, установлен 5″-ДНК сегмент, кодирующий предлагаемый эндогенный сигнальный полипептид, который непосредственно предшествует аминокислотной последовательности предполагаемого зрелого иммунного интерферона человека. Эти открытия облегчает разработку средств и способов получения с помощью рекомбинантной технологии ДНК достаточного количества иммунного интерферона человека, что обеспечило, в свою очередь, возможность определения его биохимических свойств и биоактивности.

Публикации и другие материалы, использованные для освещения предпосылок изобретения, а также в ряде случаев для освещения дополнительных подробностей, касающихся его применения, включены посредством ссылок, для удобства пронумерованы в нижеследующем тексте и соответствующим образом расположены в прилагаемом списке библиографии.

A. Иммунный интерферон человека

Интерфероны человека можно классифицировать на три группы в зависимости от различной антигенности и биологических и биохимических свойств.

Первую группу составляет семейство лейкоцитарных интерферонов ( -интерферон, Le IF или IFN- ), которые обычно вырабатываются, в основном, соответствующими клетками крови человека под действием вирусов. Эти интерфероны были получены микробиологическим способом и была обнаружена их биологическая активность (1, 2, 3). Их биологические свойства определили их использование в клиниках в качестве терапевтических агентов при лечении вирусных инфекций и злокачественных состояний (4).

Во второй группе находится фибробластный интерферон человека ( — интерферон, FIF или IFN- ), вырабатываемый обычно фибробластами под действием вирусов, который также был получен микробиологическим способом, и было обнаружено, что он демонстрирует широкий спектр биологических активностей (5). Клинические испытания также указывают на его потенциальную терапевтическую ценность. Лейкоцитарные и фибробластные интерфероны имеют очень заметное сходство в их биологических свойствах, несмотря на тот факт, что степень гомологии на аминокислотном уровне относительно низка. Кроме того, обе группы интерферонов содержат от 165 до 166 аминокислот и являются кислотными стабильными белками.

Иммунный интерферон человека ( — -интерферон, IIF или IFN- ), который составляет предмет настоящего изобретения в противоположность — и — интерферонам, pH 2 лабилен, его получают главным образом митогенной индукцией лимфоцитов и он также совершенно отличен по антигенным свойствам. До недавнего времени иммунный интерферон человека можно быть получать лишь в очень незначительных количествах, что, естественно, затрудняло его характеристику. Недавно было сообщено о гораздо более высокой, но все еще частичной очистке иммунного интерферона человека (6). Как сообщалось, это соединение было получено из культур лимфоцитов, стимулированных сочетанием фитогемагглютинина и сложного эфира форбола, и было очищено при помощи последовательных хроматографических разделений. В результате этой процедуры получили продукт с молекулярной массой 58000.

Иммунный интерферон человека получали в очень малых количествах трансляций мРНК в осциты, проявляющие характеристики интерферонной активности иммунного интерферона человека, причем выражалась надежда, что кДНК иммунного интерферона можно будет синтезировать и клонировать (7).

Полученное до сих пор количество иммунного интерферона явно недостаточно для проведения не вызывающих сомнений экспериментов по характеристике и определению биологических свойств очищенной компоненты. Однако при исследованиях in vitro, проведенных с неочищенными препаратами, также как и in vivo — экспериментах с препаратами — интерферона крыс, предполагалось, что основной функцией иммунного интерферона может быть функция иммунорегулирующего агента (8 и 9). Иммунный интерферон обладает не только противовирусной и противоклеточной активностью, общей для всех интерферонов человека, но и потенцирующим действием на эти активности — и -интерферонов (10). Кроме того, антипролиферативное действие -интерферона на опухолевые клетки in vitro, как сообщается, приблизительно враз выше нежели действие других классов интерферонов (8, 11, 12). Этот результат вместе с его выраженной иммунорегуляторной ролью (8 и 9) предлагает гораздо более выраженную противоопухолевую способность для IFN- , чем для FN- и IFN- . Действительно в экспериментах in vivo с мышами и крысами IFN- препараты демонстрируют заметное превосходство по сравнению со стимулированными против вируса интерферонами в плане противоопухолевой активности против остеогенной саркомы (13).

Все эти исследования до настоящего изобретения приходилось выполнять на существенно загрязненных препаратах из-за их чрезвычайно малой доступности. Однако они однозначно подтверждали очень важные биологические функции иммунного интерферона. Иммунный интерферон обладает не только основной противовирусной активностью, но также, вероятно, сильной иммунорегуляторной и противоопухолевой активностью, что явно определяет его как потенциально многообещающий клинический объект.

Было явно, что применение технологии рекомбинантной ДНК должно быть наиболее эффективным путем получения необходимых больших количеств иммунного интерферона человека. Независимо от того, будут ли полученные таким образом вещества включать гликозилирование, которое рассматривают как характеристику природного, полученного от человека материала, они будут, по-видимому, демонстрировать биоактивность, определяющих их клиническое применение при лечении широкого ряда вирусных заболеваний, новообразований и состояний с подавленным иммунитетом.

B. Технология рекомбинантной ДНК

Технология рекомбинантной ДНК достигла зрелости.

Молекулярные биологи способны достаточно легко рекомбинировать различные последовательности ДНК, создавая новые виды ДНК, способные продуцировать значительные количества экзогенных белковых продуктов в трансформированных микробах. В основном средства и способы для in vitro связывания различных фрагментов ДНК с тупыми или «липкими» концами разработаны, с их помощью получают потенциальные векторы экспрессии, пригодные для трансформации конкретных микроорганизмов, за счет чего регулируют направленный синтез нужных экзогенных продуктов. Однако для отдельных продуктов этот путь остается достаточно трудным, и наука не достигла еще той стадии, на которой можно гарантировать успех.

Плазмида, нехромосомная петля двунитевой ДНК, найденная в бактериях и других микробах, и часто в виде множества копий на клетку остается основным элементом рекомбинантной ДНК технологии. В информацию, закодированную в ДНК плазмиды, включена информация, необходимая для репродуцирования плазмиды в дочерних клетках (то есть, источник репликации) и обычно одна или более фенотипических характеристик селекции, таких как устойчивость к антибиотикам для бактерий, которая позволяет клонам клетки хозяина, содержащим интересующую плазмиду, быть узнанными и предпочтительно расти на селективной среде. Польза плазмид состоит в том факте, что их можно специфически расщеплять той или другой рестикционной эндонуклеазой или «рестрикционным ферментом», каждый из которых узнает различные участки ДНК плазмиды. После этого гетерологичные гены или генные фрагменты можно включать в плазмиду путем присоединения концами к участку расщепления или к реконструированным концам, прилежащим к участку расщепления. Так получают так называемые репликабельные векторы экспрессии. Рекомбинацию ДНК осуществляют вне клетки, однако получаемый «рекомбинантный» репликабельный вектор экспрессии или плазмиду можно ввести в клетки способом, известным, как трансформация, с получением больших количеств рекомбинантных векторов в результате роста трансформанта. Более того, если ген соответствующим образом ориентирован по отношению к участку плазмиды, который управляет транскрипцией и трансляцией кодирующей ДНК, полученный вектор экспрессии можно использовать для реального получения полипептидной последовательности, кодируемой встроенным геном, т.е. для процесса, который носит название экспрессии.

Экспрессию инициируют в области, известной как промотор, который распознается и связывается РНК полимеразой. На транскрипционной фазе экспрессии ДНК раскручивается, открывая его как химическую матрицу для инициированного синтеза информационной РНК с последовательности ДНК. Информационная РНК, в свою очередь, транслируется в полипептид с последовательностью аминокислот, закодированной мРНК. Каждая аминокислота закодирована нуклеотидным триплетом или «кодоном», которые все вместе составляют «структурный ген», то есть ту часть, которая кодирует аминокислотную последовательность экспрессированного полипептидного продукта. Трансляции инициируется «старт» — сигналом (обычно ATG, который в полученной информационной РНК становится AUG). Так называемые «стоп» — кодоны определяют конец трансляции и соответственно присоединения следующих аминокислотных единиц. Целевой продукт можно получить, лизируя в случае необходимости клетку хозяина и отделяя продукт путем соответствующих методов очистки от остальных белков.

На практике применение технологии рекомбинантной ДНК может обеспечить экспрессию полностью гетерологичных полипептидов (так называемая прямая экспрессия) или в другом варианте — гетерологичных полипептидов, присоединенных к участку аминокислотной последовательности гомологичного полипептида. В последнем случае целевой биоактивный продукт иногда остается неактивным в слитом гомологично-гетерологичном полипептиде до тех пор, пока он не будет отщеплен во внеклеточное окружение (см. опубликованный патент Великобритании NA и American Scientist 68, 664 (1980).

C. Технология клеточной культуры.

Искусство культур клеток или тканей для изучения генетики и физиологии клеток хорошо разработано. Известны устройства и способы поддержания перманентных линий клеток, полученных последовательной серией переносов из изомированных нормальных клеток. Для применения в исследованиях такие клеточные линии поддерживают на твердых подложках в жидкой среде или выращивают в суспензии, содержащей поддерживающие питательные вещества. Получение более крупных партий препаратов сводится лишь к механическим проблемам. Более подробное описание предпосылок изобретения можно найти в Microbiology and Edition, Harpes and Row Reblishers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), особенно на стр. 1122, и далее Scientific American 245, 66 и далее (1981), каждая из которых включена здесь в качестве ссылки.

Настоящее изобретение основано на открытии, что технологию рекомбинантной ДНК можно с успехом использовать для получения иммунного интерферона человека, предпочтительно в непосредственной форме и в количествах, достаточных для инициирования и проведения тестов на животных и в клиниках, что необходимо перед выходом на рынок. Этот продукт пригоден для использования во всех его формах для профилактики и лечения вирусных инфекций, злокачественных новообразований и состояний с подавленной или дефектной иммунной системой. Его варианты включают различные олигомерные формы, которые могут включать гликозилирование. Этот продукт получают в перестроенных генетически трансформированных микроорганизмах или в трансформированных системах клеточных культур.

В используемом здесь контексте термин «клетка-трансформант» относится к клетке, в которую ведена ДНК, причем указанная ДНК является продуктом экзогенной ДНК-рекомбинации, и к потомству любой такой клетки, которое сохраняет введенную таким путем ДНК.

Так, теперь стало возможно получать и выделять иммунный интерферон человека более эффективно, чем было возможно ранее. Одним из существенных факторов настоящего изобретения в его наиболее предпочтительном варианте является осуществление возможности генетически направить микроорганизм или клеточную культуру на продуцирование иммунного интерферона человека в достаточных для выделения количествах, секретированных клетках хозяина в зрелой форме.

Настоящее изобретение включает полученный таким образом иммунный интерферон человека, средства и способы его получения. Далее настоящее изобретение направлено на способные к репликации векторы экспрессии ДНК, хранящие последовательности генов, кодирующих иммунный интерферон человека в доступной для экспрессии форме.

Настоящее изобретение направлено также на штаммы микроорганизмов или клеточные культуры, трансформированные векторами экспрессии, описанными ранее, и на микробные или клеточные культуры таких трансформированных штаммов или культур, способные продуцировать иммунный интерферон человека. Еще в одном аспекте настоящее изобретение направлено на различные процессы, пригодные для получения указанных последовательностей гена иммунного интерферона, векторов экспрессии ДНК, штаммов микроорганизмов и клеточных культур и на их конкретные варианты. Кроме того, настоящее изобретение направлено на получение ферментационных культур указанных микроорганизмов и клеточных культур.

Настоящее изобретение направлено также на получение иммунного интерферона человека как продукта прямой экспрессии секретированного клетками хозяина в зрелой форме. Это достижение может использовать ген, кодирующий последовательность зрелого иммунного интерферона человека, плюс 5″-фланкирующую ДНК, кодирующую сигнальный полипептид. Считают, что сигнальный полипептид служит для транспорта молекулы к стенке клетки организма хозяина, где он отщепляется во время процесса секреции зрелого человека. Этот вариант делает возможным выделение и очистку целевого зрелого иммунного интерферона, не обращаясь к включению процедуры, предназначенной для удаления примесей внутриклеточного белка хозяина или клеточных осколков.

Встречающееся в тексте выражение «зрелый иммунный интерферон человека» означает продукт микробной или клеточной культуры иммунного интерферона человека, не содержащий сигнального пептида или последовательности препептида, который обязательно сопровождает трансляцию мРНК иммунного интерферона человека.

Первый рекомбинантный иммунный интерферон человека, полученный в соответствии с настоящим изобретением, имеет метионин в качестве своей первой аминокислоты (представлен в результате включения кодона стартового сигнала ATG перед структурным геном) или в том случае, если метионин внутри — или внеклеточно отщеплен, имеет в качестве нормальной первой аминокислоты цистеин. Зрелый иммунный интерферон человека можно также получить в виде конъюгата с белком, отличным от обычного сигнального полипептида, причем конъюгата, который может быть специфически расщеплен внутри или вне клетки (см. публикацию патента Великобритании NA). И, наконец, зрелый иммунный интерферон человека можно получить прямой экспрессией без необходимости отщепления каких-либо посторонних излишних полипептидов. Это особенно важно в тех случаях, когда данный хозяин не способен удалять или удаляет недостаточно эффективно сигнальный пептид, а вектор экспрессии предназначен экспрессировать зрелый интерферон человека вместе с его сигнальным пептидом. Полученный таким образом зрелый иммунный интерферон человека выделяют и очищают до уровня, удовлетворяющего требованиям, необходимым для применения при лечении вирусных заболеваний, злокачественных новообразований и состояний с подавленным или недостаточным иммунитетом.

Иммунный интерферон человека был получен следующим образом.

1. Ткани человека, например, ткань селезенки человека или периферические лимфоциты крови культивировали с митогенами для стимулирования продукции иммунного интерферона.

2. Осадок клеток из такой клеточной культуры экстрагировали в присутствии ингибитора рибонуклеазы с целью всей цитоплазмической РНК.

3. На олиго-dТ колонке выделили тотальную информационную РНК (мРНК) в полиаденилированной форме. Эту РНК расфракционировали по размерам, используя градиент плотности сахарозы и гель электрофорез в присутствии кислоты-мочевины.

4. Соответствующую РНК (от 12S до 18S) превратили в соответствующую однонитевую комплементарную ДНК (мДНК), из которой получили двунитевую кДНК. После поли — dC удлинения ее включили в вектор так, чтобы плазмида имела один или более фенотипических маркеров.

5. Полученные таким образом векторы использовали для трансформации бактериальных клеток с получением библиотеки колоний. Меченные радиоизотопами кДНК, полученные как из индуцированных, так и из неиндуцированных РНК, выделенных как описано ранее, использовали для раздельного определения дубликатных библиотек колоний. Затем избыток кДНК удаляли и колонии экспонировали на рентгеновской пленке для идентификации индуцированных клонов кДНК.

6. Из индуцированных клонов кДНК выделили соответствующую плазмидную ДНК и определили в ней последовательность оснований.

7. Секвенированную ДНК подготовили in vitro для включения в соответствующий вектор экспрессии, который использовали для трансформации подходящей клетки хозяина, который, в свою очередь, дали возможность расти в культуре и экспрессировать целевой иммунный интерферон человека.

8. В некоторых системах клеток хозяина, будучи включена в вектор экспрессии так, чтобы быть экспрессированной вместе с сигнальным пептидом, зрелая форма иммунного интерферона человека секретируется в среду клеточной культуры, что облегчает выделение и методы очистки.

Описание предпочтительных вариантов изобретения.

A. Система клеточных культур/векторы клеточных культур.

Размножение клеток позвоночных в культуре (культура ткани) стало обычной процедурой за последние годы (см. Tissue Culture Academic Riess Kruse and Paterson ends, 1973). В данном случае использовали COS — 7 линию фибробластов почки обезьян в качестве хозяина для получения иммунного интерферона (25a). Однако подробно описанные здесь опыты можно проводить на любой линии клеток, которая способна к репликации и экспрессии совместимого вектора, например, W138, BHK, 3T3, CHO, VERO и линий клеток HeLa. Кроме того, необходимо, чтобы вектор экспрессии имел сайт инициации репликации и промотор, расположенный перед геном, подлежащим экспрессии, вкупе с необходимыми также участками связывания рибосомы, участками сплайсинга РНК, участками полиаденилирования и транскрипционными терминаторами. Хотя здесь были использованы эти важные элементы SV40, следует иметь в виду, что изобретение, хотя оно и описано здесь с точки зрения его предпочтительного варианта, не следует рассматривать как ограниченное лишь этими последовательностями. Так, например, могут быть использованы источники репликации других вирусных (например, Polyoma, Adeno, VSV, BPV и т.д.) векторов, а также клеточные источники репликации ДНК, которые могут функционировать в неинтегрированном состоянии.

B. Экспрессия в культуре клеток млекопитающих.

Стратегия синтеза иммунного интерферона в культуре клеток млекопитающих основана на разработке вектора, способного как к автономной репликации, так и к экспрессии чужого гена под контролем гетерологичного транскрипционного фрагмента. Репликация этого вектора в культуре ткани обеспечивалась за счет стимуляции инициатора репликации ДНК (происходящего из вируса SV 40) и стимуляции вспомогательной функции (T антиген) путем введения вектора в линию клеток, эндогенно экспрессирующих этот антиген (23 и 29). Поздний промотор вируса SV 40 предшествует структурному гену интерферона и обеспечивает транскрипцию гена.

Вектор, который использовали для получения экспрессии , состоял из последовательностей pBR 322, которая обеспечивает маркер, пригодный для отбора в E. coli (устойчивой к ампициллину), а также инициатор репликации ДНК. Эти последовательности были получены из плазмиды pML — 1 (28) и представляют область, содержащую ECo RI и Bam HI рестрикционные сайты. SV 40 инициатор получен в составе фрагмента PVu II — Hind III размером 342 п.о., включающего эту область (30 и 31) (причем оба конца превращены в концы Eco RI). Эти последовательности, кроме того, что содержат вирусный инициатор репликации ДНК, кодируют промотор как для ранней, так и для поздней транскрипционной единицы, ориентация участка инициации из SV — 40 была такова, что промотор для поздней единицы транскрипции был расположен проксимально по соотношению к гену, кодирующему интерферон.

На фиг. 1 изображено градиентное сахарозное центрифугирование поли(А) + РНК стимулированных лимфоцитов периферической крови. Наблюдается два максимума активности интерферона (показано заштрихованными прямоугольниками) с размерами 12S и 16S. Расположение маркеров рРНК (центрифугированных независимо) помечено над контуром поглощения.

На фиг. 2 изображен электрофорез поли (A) + РНК стимулированных PBL на кислота-мочевина-агарозе. Наблюдается только один максимум активности, который мигрирует совместно с 18S РНК. Положение рибосомных маркеров РНК, которые были подвергнуты электрофорезу на прилежащей дорожке и проявлены окрашиванием этидиум бромидом, помечено выше контура активности.

На фиг. 3 изображены картины гибридизации 96 колонии с индуцированными и неиндуцированными 32 P меченными кДНК пробами. 96 индивидуальных трансформантов выращивали на пластине для микротитрования, реплика была помещена на две нитроцеллюлозные мембраны, а затем фильтры гибридизовали с 32 P-кДНК образцами, полученными либо из индуцированных мРНК (вверху), либо из мРНК, выделенных из неиндуцированных культур pBL (неиндуцированные, внизу ). Фильтры промывали для удаления негибридизованных РНК, а затем экспонировали на пленке для рентгеновских лучей. Эта серия фильтров представляет 86 таких серий (8300 независимых колоний). Примером индуцированного клона является помеченный H12.

Фиг. 4 является рестрикционной картой вставки кДНК клона 69. Вставка кДНК связана с сайтами PstI (точки с обоих концов) и олиго-dC-dG «хвостами» (прямые линии). Число и размеры фрагментов, полученных расщеплением рестрикционными нуклеазами, были установлены с помощью электрофореза 6% акриламидном геле. Положения участков были подтверждены секвенированием (представлено на фиг. 5). Кодирующий участок самой большой открытой рамки считывания обведен, заштрихованный участок представляет 20 остатков последовательности сигнального пептида, тогда как участок с точечным пунктиром представляет последовательность зрелого IEN (46 аминокислот); 5″ — конец мРНК находится слева, а 3″ конец находится справа.

На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность вставки кДНК плазмиды р69. Представлена также «выведенная» последовательность аминокислот наиболее длинного открытого участка считывания. Предполагаемая сигнальная последовательность представлена остатками, помеченными от S1 до S20.

На фиг. 6 приведена схема плазмиды pSV 69, использованной для экспрессии IFN- в клетках обезьяны.

Фиг. 7 изображает Саузерн-гибридизацию 8 различных переваренных Eco RI человеческих геномных ДНК, гибридизованных с 32 P-меченным DdeI- фрагментом 600 п.о. из кДНК-вставки p69. Два Eco RI-фрагмента явно гибридизованы с зондом в каждом образце ДНК.

На фиг. 8 представлена Саузерн-гибридизация человеческой геномной ДНК, переваренной 6 различными рестрикционными эндонуклеазами, гибридизованной с 32 P-меченным зондом из p69.

А. Источник IFN- мРНК

Лимфоциты периферической крови (PBL) были получены от доноров (людей) с помощью лейкофореза. Далее PBL были очищены градиентным центрифугированием в смеси фиколл-гепарин, а затем их культивировали при концентрациикл/мл в RPMI 164 с 1 % L-глутамина, 25 мМ HEPS и 1 % раствора пенициллин-стрептомицин (Gibco Jrand gsland, Ny). Эти клетки индуцировали для получения IFN- митогенным стафилококковым энтеротоксином B (N мкг/мл) и культивировали в течениеч при 37 o C в 5 % CO. К культуре PBL добавили дезацетилтимозин — — (0,1 мкг/мл) для повышения относительного выхода IFN- активности.

В. Выделение информационной РНК.

Тотальную РНК из культур PBL экстрагировали, в основном, в соответствии с сообщением Bergen, S.L. et al. (33). Клетки выделяли центрифугированием, а затем повторно суспендировали в 10 мМ NaCl, 10мМ TrCS-HCl (pH 7,5), 1,5мМ MgCl2 и 10 мМ рибонуклеозид-ванадильного комплекса. Клетки лизировали, добавляя NP-40 (конечная концентрация 1%), и ядра выделяли центрифугированием.

Надосадочная жидкость содержала тотальную РНК, которую очистили далее многократными экстракциями фенолом и хлороформом. Водную фазу довели до 0,2М NaCl, а затем все РНК осадили, добавив два объема этанола. РНК неиндуцированных (нестимулированных) культур выделили таким же способом. Для очистки мРНК от остальных видов РНК использовали олиго-dТ целлюлозную хроматографию (34). Типичные выходы из 1-2 л культивированных PBL составляли 5-10 мг тотальной РНК имкг поли(А) + PHK.

C.Фракционирование мРНК по размерам.

Для фракционирования препаратов мРНК использовали два способа. Эти способы использовали независимо ( а не вместе) и каждый из них приводил к значительному обогащению IFN — мРНК.

Для фракционирования мРНК использовали сахарозное градиентное центрифугирование в присутствии денатуранта формамида. Градиенты от 5 до 25 % сахарозы в 70 %-ном формамиде (32) центрифугировали приg в течение 19 ч при 20 o C. Последовательные фракции (0,5 мл) выделяли затем с верхней части градиента, осаждали этанолом, а затем аликвоты вводили в социты Xenopus laevis для трансляции мРНК (35). Спустя 24 ч при комнатной температуре инкубационную среду стандартным методом ингибирования цитопатического эффекта исследовали на противовирусную активность, используя при этом Vesicular Stomatitis вирус (штамм Indiana) или вирус Eucepholomycarditis на клетках WISH (амнион человека) по описанию Стюарта (36), за исключением того, что образцы инкубировали с клетками в течение 24 ч (вместо 4) перед заражением вирусом. Соответственно наблюдали два пика активности для РНК, фракционированных в сахарозном градиенте (фиг. 1). Один пик седиментировал с рассчитанным размером 12S и содержалед/мл антивирусной активности (по сравнению со стандартом IFN- ) на мкг введенной РНК.

Другой пик активности седиментировал с размером 16S и содержал около половины активности более медленно седиментированного пика. Каждый из этих пиков активности, по-видимому, связан с IFN- , так как для тех же фракций, исследовавшихся на линии бычьих клеток (MDBK), которые не защищены человеческим IFN- , не наблюдалось никакой активности. Как активность IFN- , так и активность IFN- , можно легко определить, исследуя МДВК (5).

Фракционирование мРНК (260 мкг) проводили также электрофорезом через кислотно-мочевинные агарозные гели. Вязкий агарозный гель (37 и 38) состоял из 1,75 % агарозы. О,025 М цитрата натрия, pH 3,8 и 6М мочевины. Электрофорез проводили в течение 7 ч при 25 мА и 4 o C. Затем гель разрезали лезвием бритвы. Отдельные ломтики расплавляли при 70 o C, после чего дважды экстрагировали фенолом и один раз хлороформом. Фракции осаждали этанолом, последовательно анализировали на предмет содержания мРНК IFN- введением в социты Xenopus laevis и затем проводили противовирусный анализ. Для фракционированных в геле образцов наблюдали только один пик активности (фиг. 2). Этот пик выходит вместе с 18S и имеет активность 600 ед/мл на микрограмм введенной РНК. Эта активность также, по-видимому, специфична для IFN- , так как не защищает клетки МДВК. Расхождение размеров, наблюдавшееся на сахарозных градиентах (12S и 16S) и кислотно-мочевинных гелях (18S) можно объяснить тем, что эти независимые методы фракционирования проводились в неодинаковых условиях полного денатурирования.

Д. Получение библиотеки колоний,

содержащих последовательности IFN- .

3 мг фракционированных в геле мРНК использовали для получения двунитевой кДНК по стандартным методикам ( 26 и 39)); кДНК фракционировали по размерам на 6% полиакриламидном геле. Фракции двух размеров электроэлюировали,0 п.о. (138 ng) и > 1500 п.о.(204 ng). Порции 35 ng каждого размера кДНК удлинили дезокси C-остатками, используя терминальную дезоксинуклеотидтрансферазу (40), и отжигали с 300 ng плазмиды pBK 322 (41), которая была аналогично сшита с дезокси-остатками в сайте Pst I(40). Каждую ренатурированную смесь трансформировали затем в E.coli К12 штамм 294. Получили приблизительно 8000 трансформантов с кДНКп.о. и 400 трансформантов кДНК > 1500 п.о.

Е. Выделение из библиотеки колоний,

Полученные колонии отдельно инокулировали в лунки пластинок для микротитрования, содержащих LB (58) + 5 мгк/мл тетрациклина и хранившихся при — 20 o C после добавления ЖДМСО до 7 %. Две копии библиотеки колоний выращивали на нитроцеллюлозных фильтрах и ДНК из каждой колонии фиксировали на фильтре по методу Gruushtein — Hogness (42).

32 P — меченные кДНК зонды приготовили, используя гельфракционированные мРНК размером 18S из индуцированных и неиндуцированных культур РВL. В качестве праймеров использовали олиго-d Т 12-18; применялись условия реакции, описанные ранее (I). Фильтры, содержащие 8000 трансформантов с размером кДНКп.о. и 400 трансформантов с размером кДНК более 1500 п.о. гибридизовали ссрм индуцированных 30 P -кДНК. Дублирующий набор фильтров гибридизовали ссрм неиндуцированных 32 P- кДНК. Гибридизацию проводили в течение 16 ч, используя условия, описанные Fritsch et al (43). Фильтры тщательно промыли (43), а затем экспонировали на Кодаковской пленке XR-5 для рентгеновских лучей с помощью Du Pont Lighitning-Plus. интенсифицирующих экранов в течениеч. Сравнивали картину гибридизации для каждой колонии с двумя пробами.

Приблизительно 40 % колоний явно были гибридизованы с обоими зондами, тогда как приблизительно 50 % колоний не подверглись гибридизации ни с одним зондом (см. фиг. 3). 124 колонии были гибридизованы заметно с индивидуальным зондом, но недетектируемо или очень слабо — с неиндуцированным зондом. Эти колонии индивидуально инокулировали в лунки пластинок для микротитрования, вырастили и перенесли на нитроцеллюлозные фильтры, а затем гибридизовали с теми же двумя пробами, как описано выше. Плазмидная ДНК, выделенная из каждой из этих колоний быстрым способом (44), была также связана с нитроцеллюлозными фильтрами и гибридизована (45) со стимулированными зондами. ДНК из 22 колоний, гибридизовавшееся только с индукционными зондами, были названы «индуцированными» колониями.

F. Характеристики индуцированных колоний.

Плазмидную ДНК получили из 5 индуцированных колоний (46) и использовали для того, чтобы охарактеризовать кДНК вставки. Рестрикционное мечение пяти индуцированных плазмид (р67, р68, р69, р70 и р71) показало, что четыре из них имеют аналогичные рестрикционные карты. Эти четыре плазмиды (р67, р69, р71 и р72) имеют каждая четыре Dde участка, 2 Hinf 1 участка и один Rsa 1 участок во вставке кДНК. Пятая плазмида (р68) содержит обычный Dde 1 фрагмент и, по-видимому, является коротким кДНК-клоном, относящимся к остальным четырем. Гомологичность, предполагаемая на основании картрирования с помощью рестрикционных нуклеаз, была подтверждена гибридизацией. Приготовили 32 P-меченную ДНК пробу (47) из DdeI фрагмента размером 600 п.о. плазмиды р67 и использовали для гибридизации (42) с остальными индуцированными колониями. Все пять картрированных рестрикционных нуклеазой колоний перекрестно гибридизовались с этим зондом, как и 17 других колоний из 124, выбранных при скрининге. Длину вставки кДНК в каждой из этих перекрестно гибридизирующихся плазмид определяли по перевариванию PstI и с помощью гельэлектрофореза. Клон с самой длинной кДНК-вставкой, по-видимому, является клоном 69 с размером вставки п.о. Эту ДНК использовали во всех дальнейших экспериментах, ее рестрикционная карта приведена на фиг. 4.

Вставка кДНК в р69, как было показано, является IFN- кДНК по полученным в трех независимых системах экспрессии продуктам, проявлявшим противовирусную активность, как описано более подробно infra.

G. Анализ последовательной вставки кДНК р69.

Полная нуклеотидная последовательность плазмидной p69 кДНК-вставки была определена методом дидеоксинуклеотидного обрыва цепи (48) после субклонирования фрагментов в M 13 вектор m 7 (49) и химическим методом Максама и Гилберта (52). Наиболее длинная открытая рамка считывания кодирует белок из 166 аминокислот, представленный на фиг. 5. Первый остаток кодирует первый метиониновый кодон, включенный в 5″-конец кДНК. Первые 20 остатков у аминоконца, вероятно, служат сигнальной последовательностью для секреции остальных 146 аминокислот. Эту предполагаемую сигнальную последовательность с другими известными сигнальными последовательностями объединяют, например, размеры и гидрофобность. Кроме того, четыре аминокислоты, найденные у предполагаемой отщепляемой последовательности (ser-leu-glu-cys) были идентичны с четырьмя остатками, найденными в точке отщепления нескольких лейкоцитных интерферонов (LeIF B, C, D, F и H (2)). Закодированная зрелая аминокислотная последовательность из 146 аминокислот (именуемая в дальнейшем «рекомбинантный человеческий иммуноинтерферон») имеет молекулярную массу 17140.

Имеются два потенциальных положения гликозилирования (50) в закодированной белковой последовательности, у аминокислот от 28 до 30 (asn-gly-thr) и аминокислот от 100 до 102 ( asn-tyr-ser). Существование этих положений согласуется с наблюдавшимся гликозилированием человеческого IFN- (6 и 51). Кроме того, единственные два цистеиновых остатка (положения 1 и 3) стерически слишком близки, чтобы образовывать дисульфидный мостик, что согласуется с наблюдавшейся стабильностью IFN- в присутствии таких восстанавливающих агентов, как IFN- — меркаптоэтанол (51). Выведенная зрелая аминокислотная последовательность, в общем, является основной, имея в сумме 30 лизиновых, аргининовых и гистидиновых остатков и всего 19 остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Структура мРНК IFN- , установленная из ДНК последовательности плазмиды р69, заметно отличается от IFN- (1,2) или IFN- (5) мРНК. Так, кодирующий участок IFN- короче, хотя 5″ нетранслируемый и 3″-нетранслируемый участки гораздо длиннее, чем в IFN- FN- и IFN- .

H. Структура кодирующей последовательности гена IFN- .

Структура гена, кодирующего IFN- , анализировали гибридизацией. В этой процедуре (54) 5 мкг высокомолекулярной человеческой ДНК (полученной по методу 55) переваривают до завершения с различными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез на 1,0 % агарозном геле (56) и переносят на нитроцеллюлозный фильтр (54). 32 P-меченную пробу ДНК приготавливают (47) из DdeI фрагмента размером 600 п.о. кДНК-вставки р69 и гибридизуют (43) с ДНК пятном на фильтре. 10 7 импульсов в минуту пробы гибридизовали в течение 16 ч, а затем промывали как описано (43). Восемь геномных ДНК образцов от различных доноров (людей) переваривали Eco RI и гибридизовали с р69 32 P-меченным зондом. Как представлено на фиг. 7, наблюдается два четких сигнала гибридизации с размерами 8,8 m.п.о. и 2,0 m.п.о., что установлено путем сравнения подвижностей с Hind III переваренной -ДНК . Это могло быть результатом наличия или двух генов IFN- , или одного гена, расщепленного по Eco RI сайту. Так как р69 кДНК не содержит Eco RI сайтов, для объяснения наличия его в гене придется допустить промежуточную последовательность (интрон) с внутренним участком Eco RI. Для того, чтобы сделать различие между этими двумя возможностями, провели еще одну гибридизацию саузерна с тем же зондом и пятью другими эндонуклеазными перевариваниями одной человеческой ДНК (фиг. 8). По два гибридизуемых фрагмента ДНК наблюдали для других эндонуклеазных перевариваний, PVUII — 6,7 т.п.о. и 4,0 и Hinc II (2,5 т.п.о. и 2,2 т.п.о.). Однако три остальные картины эндонуклеазного переваривания дают только один гибридизующийся ДНК-фрагмент: Hind III (9,0 т.п.о.), Bdl II (11,5 т.п.о.) и BamHI (9,5 т. п. о. ) Два IFN- гена должны быть связаны необычно коротким расстоянием (менее 9,0 квр), чтобы оказаться в одном и том же Hihd III фрагменте. Этот результат предполагает, что только один гомологичный IFN- ген (в отличие от многих связанных с IFN- генов) присутствует в человеческой геномной ДНК и что этот ген разделен одним или более интронов, содержащих Eco RI, PVU II и Hind II сайты. Это предположение было подтверждено гибридизацией 32 P-меченного (47) фрагмента, полученного из 3″-нетранслируемого участка кДНК из р69 (130 п.о. Dde I фрагмент от 860 положения до 990 положения на фиг. 5) с Eco RI переваром человеческой геномной ДНК. Только 2,0 т.п.о. Eco RI фрагмент гибридизуется с этим зондом, указывая на то, что этот фрагмент содержит 3″-нетранслированные последовательности, тогда как 3,8 т.п.о. Eco RI фрагмент содержит 5″-последовательности. Структура гена IFN- (один ген по крайней мере с одним интроном) существенно отличается от IFN- (множество генов (2) без интронов (56)) или IFN- (один ген без интронов (57)).

J. Конструирование вектора клеточной культуры pSV 69.

Фрагмент из 342 пар оснований Hind III- PVU III, включающий инициатор SV 40, превратили во фрагмент, связанный с Eco R I рестрикционным сайтом. Hind III сайт превратили добавлением синтетического олигомера (5d AGCTGAATTC) и PVU II сайт превратили сшиванием по тупому концу в Eco RI сайт, дополнив его с использованием полимеразы I (фрагмент Кленова). Полученный Eco RI фрагмент вставили в Eсо RI сайт pML — (28). Плазмиду с поздним промотором SV 40, ориентированным в сторону от amp R гена, далее модифицировали, удалив Eco R I — сайт, ближайший к amp R гену pML — 1 (27).

Был выделен фрагмент размером 1023 пар оснований HpaI — BglII из клонированной HBV ДНК (60), и HpaI сайт вируса гепатита B (HBV) превратили в Eco RI сайт с синтетическим олигомером (5″dGGGAATTCGC). Этот Eco RI-Bgl II фрагмент непосредственно клонировали в Eco RI — BamH I сайты плазмиды, описанной ранее и несущей инициатор SV 40.

В оставшийся Eco R I — сайт вставили кодирующую IFN- последовательность на Pst I фрагменте р69 из 1250 п.о. после конверсии PstI концов в Eco R I концы. Выделили те клоны, в которых поздний промотор SV 40 предшествовал гену IFN- . Полученная плазмида pSV 69 (фиг. 6) была затем введена в клетки культур тканей (29), в частности COS-7 клетки, с использованием ДЕАЕ-декстранметодики (61), модифицированной таким образом, что трансфекцию в присутствии ДЕАЕ-декстрана проводили в течение 8 ч. Клеточную среду меняли каждые 2-3 дн. Ежедневно отбирали 200 мкл на интерфероновый биоанализ. Типичные выходы составилиед/мл в образцах, проанализированных три или четыре дня спустя после трансфекции.

Анализ показал, что продукт экспрессии не имеет cys-tyr-cys-N-концевой части рекомбинантного человеческого иммуноинтерферона (ср. фиг. 5), указывая на то, что явление отщепления сигнального пептида прошло по связи cys-GLN (аминокислоты 3 и 4 на фиг. 5) и что зрелый полипептит фактически состоит из 143 аминокислот (geз-cys-Tyr-cys-иммунный интерферон).

J. Частичная очистка рекомбинантного человеческого geз-cys-Tyr-cys-иммунного интерферона.

Для получения больших количеств человеческого интерферона IFN- , выделяемого обезьяньими клетками, свежие монослои COS-7 клеток в десяти 10 см пластинах были трансфецированы в общем 30 мкг рDL 1 3 в 110 мл ДЕАЕ-декстрана (200 мкг/мл ДЕАЕ декстранMW; 0,05 М трис pH 7,5 в ДМЕМ). Спустя 16 ч при 37 o C, пластины промыли дважды ДМЕМ. 15 мл свежей ДМЕМ с добавлением 10 % f.b.s., 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл пенициллина G и 50 мг/мл стрептомицина добавили затем на каждую пластину. Среду заменили освобожденной от сыворотки ДМЕM. Свежую, свободную от сыворотки среду добавляли затем ежедневно. Собранную среду хранили при 4 o C до тех пор, пока не использовали для анализа, или связывали с CPG. Было обнаружено, что фракции, собранные спустя 3 и 4 дн после трансфекции, сохраняли практически всю активность.

0,5 г CPG (контролируемое пористое стекло Electonucleonics CPG 350 размер в мешках 120/200) добавляли к 100 мл клеточной надосадочной жидкости, и полученную смесь перемешивали в течение 3 ч при 4 o C. После недолгого центрирования в beuch top центрифуге осевшие шарики набили в колонку и тщательно промыли буфером 20 мМ NaPO4, 1M NaCl, 0,1 % -меркаптоэтанол, pH 7,2. Затем активность элюировали тем же самым буфером, содержащим 30 % этиленгликоля с последующим элюированием вышеуказанным буфером, содержащим 50 % этиленгликоль. Практически вся активность связана с CPG. 75 % элюированной активности нашли во фракциях, элюированных с 30 % этиленгликолем. Эти фракции собрали и разбавили 20 мМ NaPO4 1M NaCl, pH 7,2 до финальной концентрации 10 % этиленгликоля и непосредственно вводили в 10 мл колонку Con A Sepharose (Pharmacia). После тщательной промывки 20 мМ NaPO4 — 1M NaCl, pH 7,2 активности элюировали 20 мМ NaPO4 — 1M NaCl — 0,2 M -метил-Д-маннозидом. Существенное количество активности (55 %) не связано с этим лектином, 45 % активности элюировано -метил-Д-маннозидом.

К. Фармацевтические композиции.

Соединения настоящего изобретения можно включить в соответствии с известными способами в фармацевтически приемлемые композиции, в которых человеческий иммунный интерферон соединяют в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители и их композиции описаны в Pemington»s Pharmaceutical Science, которая включена в виде ссылки. Такие композиции должны содержать эффективное количество белка интерферона в соответствии с настоящим изобретением вместе с подходящим количеством носителя для получения фармацевтически приемлемой композиции, подходящей для эффективного введения больному.

Человеческий иммунный интерферон настоящего изобретения можно парэнтерально вводить пациенту, для которого необходимо противоопухолевое или противовирусное лечение, а также тем, кто находится в иммуноподавленном состоянии. Дозы и частота приема могут быть аналогичными тем, которые обычно используют в клинических исследованиях на других человеческих интерферонах; то есть около (1-10) 10 6 единиц ежедневно, а в случае материалов с чистотой выше 1 %, по-видимому, вплотьед. ежедневно. Дозы IFN- можно значительно повысить для достижения большего эффекта, что связано с практическим отсутствием человеческих белков, отличных от IFN- , которые при использовании материалов, полученных от людей, могут привести к обратному действию.

В качестве одного примера подходящей дозировки для применяемого здесь практически гомогенного IFN- в парэнтеральной форме, можно указать 3 мг. IFN- специфической активности, скажемед/мг, можно растворить в 25 мл 5 н. сывороточного альбумина (человека) USP, раствор пропустить через бактериологический фильтр и отфильтрованный раствор асептически разделить на 100 ампул, каждая из которых содержитед. чистого интерферона, пригодного для парэнтерального введения. Ампулы предпочтительно хранить на холоде (-20 o C) перед употреблением.

1. Характеристика противовирусной активности.

Для нейтрализации антител образцы разбавляли, в случае необходимости, до концентрации0 ед/мл, добавляя PBS — BSA. Равные объемы образца инкубировали в течение 2-12 ч при 4 o C с рядом разбавлений кроличьих античеловеческих лейкоцитов, фибробластов или антисыворотки иммунного интерферона. Анти-IFN- и получили из национального института аллергических и инфекционных заболеваний. Анти-IFN- приготовили, используя аустентичный IFN- (5-20 % чистоты), очищенный из стимулированных лимфоцитов периферической крови. Образцы цетрифугировали в течение 3 мин при 1200 xg за 3 мин перед исследованием. Для проверки pH 2 — стабильности образцы доводили до pH 2, добавляя 1 н. HCl, инкубировали в течение 2-12 ч при 4 o C и нейтрализовали добавлением 1 н. NaOH перед исследованием. Для тестирования натрийдодецилсульфатной (SDS) чувствительности образцы инкубировали с равным объемом 0,2 % SDS в течение 2-12 ч при 4 o C непосредственно перед анализом.

Характеристики IFN- полученного в COS — 7 клетках даны в таблице

Эта таблица показывает характеристическое поведение IFN- , , — стандартов после различных обработок. Активность интерферона, полученного COS-7/psv 69, кислотно-чувствительная, SDS чувствительная и нейтрализуется антисывороткой иммунного интерферона. Она не нейтрализуется антителами к IFN- или . Эти данные подтверждают то, что продукты, полученные в этой системе, являются иммуноинтерферонами и что к ДНК-вставка плазмиды p69 кодирует IFN- .

1. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1930).

2. Goeddel et al., Nature 290. 20(1981).

3. Yelverton et al., Nucleic Aceds Research 9. 731 (1981).

4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).

5. Goeddel et al., Nucleic Acids Reseach 8, 4057 (1980).

6. Yip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981).

7. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981).

8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).

9. Sonnenfeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978).

10. Fleishmann et al., Infection and Immunity 26, 248 (1979).

11. Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980).

12. Rudin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 5928 (1980).

13. Crane et al., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978).

14. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979).

15. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).

16. Tschumper el al. Gene 10, 157 (1980).

17. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (198 ).

18. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255,(1980).

21. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968).

22. Holland et al.. Biochemistry 17, 4900 (1978).

23. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

24. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

25a. Gluzman, Cell 23. 175 (1981).

26. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).

27. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977).

28. Lusky et al., Nature 293, 79 (1981).

29. Gluzman et al. , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).

30. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978).

31. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).

32. Boedtker et al. , Prog. in Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976).

33. Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (1979).

34. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).

35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).

36. Stewart, The Interferon System. Springer, New fork, p.(1979).

37. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).

38. Lynch el al., Virology 98, 251 (1979).

39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

40. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).

41. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977).

42. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975).

43. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980).

44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

46. Clewel et al., Biochemistry 9, 4428 (1970).

47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

48. Smith, Methods Enzymol. 61, 560 (1980).

49. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic Press, New York, p. 1 (1973).

51. Mathan et al., Nature 292, 842 (1981).

52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).

53. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).

54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).

55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).

56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).

57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).

59. Beggs, Nature 275, 104 (1978).

60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch and Fox) p. 57, Academic Press, New York (1980).

61. McCuthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения человеческого иммунного интерферона, предусматривающий культивирование линии клеток животных, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют линию клеток COS-7, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК pSVj69, и выделяют дез-Cys-Tyr-Cys -интерферон.

Источник: http://www.freepatent.ru/patents/